3335 ÇEVİRDİM

Yöntemler.  HIV ile enfekte olan ve HIV'e humoral cevap vermeyen bir hastanın nedenini ve sonuçlarını 4 yıldır araştırıyoruz. Sonuçlar.  Hasta, immün yetmezlik sendromuna hızla ilerleyen 4 ay önce, HIV ile enfekte edilmemiş nükleik asit testi ile teyit edildi. Hastanın humoral açığı HIV'e özgü: 23 valanlı pnömokok polisakkarid aşısında influenza A (H1N1) pdm09 ve tüm T hücresine bağımlı ve bağımlı serotipleri içeren tüm zorlayıcı aşılara güçlü humoral yanıtlar ekledi. Virüsün HIV-pozitif kontrol serumuna benzer gp120 antijenitesi, NL4-3 ve YU2 prototip türleri ile benzerdi. Hızlı progresyon ile ilişkili iki insan lökosit antijen alleli belirlendi (B * 08 ve B * 35) ve bir sitotoksik T-lenfosit epitop yeri varyantı belirtildi: E277K. Viral çürüme ( t 1/2 ≈ 39 hafta) göreceli olarak uzun ömürlü hücrelerin devam eden vireminin kaynağı olduğunu önermektedir. İnsan immün yetmezlik virüsü viremi, terapötik antiretroviral seviyelere rağmen hasta humoral bir immün yanıt geliştirene kadar bastırılmadı. Önemli antiretroviral seçme basıncına rağmen serum veya gastrointestinal biyopsilerden elde edilen sanal fenotipleme ile direnç saptanmadı. Sonuçlar.  Etkisiz antikor üretimi, son derece hızlı HIV ilerlemeleri alt grubu ile ilişkili olabilir. Antiretroviral terapi, enfeksiyon yayılımını yavaşlatmak için yeterli olmasına rağmen, humoral bir yanıt bulunmadığında HIV virüs temizliği için etkisiz olduğu görülmektedir. Anahtar Kelimeler : hücresel bağışıklık, HIV, humoral bağışıklık, seronegatif, serosilent HIV ile yaşayan 33 milyon kişide insan immün yetmezlik virüsü (HIV) enfeksiyonunun teşhisi için temel taş, HIV'e karşı antikor varlığıdır. HIV antikorları için serolojik testlerin başlatılmasından sonra, aktif HIV enfeksiyonunun tartışılmaz kanıtlarına rağmen "seronegatif" olduğu tespit edilen nadir bir rapor mevcuttur. HIV'e karşı bir antikor tepkisi de bağlamadı ya da montajı olağanüstü derecede yavaşladı (Spivak ve diğerleri tarafından gözden geçirildi [ 1 ]). Bu tür bireyler, konukçuya HIV cevabında humoral bağışıklık rolü hakkında bir fikir verirler. HIV'in kazanılmasından yaklaşık 7 gün sonra, viral proteinin çoğalmasıyla (p24 antijenemi olarak saptanabilir) ve bunu takiben enfeksiyondan sonra medyan 13 gün içinde viral proteinlere karşı antikorların ortaya çıktığı karakteristik bir viremiye rastlanır [ 2 ]. İlk saptanabilir serbest plazma anti-HIV antikoru tipik olarak anti-gp41 immünoglobülin (Ig) M ve / veya IgG'dir [ 2 ]. HIV kontrolünde anti-gp41 antikorlarından daha etkili olan anti-gp120 antikorları, enfeksiyondan 28 gün sonra medyan olarak saptanabilir hale gelir [ 2 ]. Şu anda, HIV enfeksiyonunun teşhisi için standart algoritma, anti-HIV IgM, anti-HIV IgG'yi ve 4. nesil testlerde p24 antijenini tespit eden bir tarama enzim bağlantılı immünosorbent assay (ELISA) 'dan oluşur. Pozitif ELISA sonuçları, bir antikor esaslı HIV Western blotu, HIV-1'i HIV-2 antikorlarından ayıran ikinci bir ELISA veya HIV nükleik asit testi ile doğrulanmalıdır [ 3 ]. Antikor temelli HIV testi, seronegatif enfeksiyonlarda yanlış negatif sonuçlara neden olabilir. Birçok durumda, kısa vadeli seronegatif HIV enfeksiyonu, ya HIV bulaşması ile antikor oluşumu arasındaki kısa pencere döneminde antikor bazlı testler ya da nadir ve atipik virüs suşlarının sahte negatif ELISA taraması gibi teknik konularda kolaylıkla açıklanabilir [ 4 ]. Antoriteroviral tedavi (ART) ile uzun yıllar boyunca viral antijen supresyonundan sonra antikor seviyeleri bir eşik değer eşiğinin altına düştüğünde Seroreversion da bildirilmiştir [ 5 ]. 25 rapor edilen seronegatif HIV enfeksiyonu [ 1 ] üzerine yapılan bir derlemede, klinik sunumlar şiddetliydi ve mortalite, enfeksiyon sonrası yakında, fırsatçı enfeksiyonlardan veya HIV'in kendisinden ortaya çıkmıştır. HIV teşhisi genellikle yüksek plazma HIV viral yükü ve ciddi depresif CD4 sayısı (her zaman <250> ART'yi başlattıktan sonra (efavirenz, tenofovir ve emtricitabin), 5 hafta sonra plazma viral yükünde 47.000 kopya / mL'ye (Nuclisens EasyQ, sürüm 1.1; BioMéieux Inc, St. Laurent, Quebec) bir azalma ve CD4'ten 80 hücre / mm'lik bir nadir 3 242 hücre / mm (% 12) 3 (% 33). Önümüzdeki 33 ay boyunca pan odaklı bir virüs için birden fazla ART rejimi uygulandı; Ancak hasta ısrarla viremik kaldı. Orta CD4 hücresi geri kazanımı, (maksimum CD4 sayısı 565 hücre / mm oldu 3 ; en fazla yüzde 37); Bununla birlikte, HIV-1 antikorlar, enfeksiyon (Şekil sonra 49 aya kadar tespit edilememiştir (Şekil 1). 1 ). Antikorların ortaya çıkmasını takiben pratik bir ilgi ile, kalıcı viremia giderildi. Genel olarak, Hasta ART'a uyarken progresif HIV / AIDS hastalığının kanıtı olmaksızın iyi klinik olarak kaldı. Lopinavir öngörülürken diyare ve tenofovir disoproksil fumarat öngörülürken geri dönüşümlü böbrek toksisitesi de dahil olmak üzere ART'den gelen advers etkiler görmüştür. Hastanın antikor yanıtını (laboratuar hatasını ekarte etmek için) monte etmediğini ve HIV ile enfekte olan bu seronegatif hastada AIDS'e aşırı hızlı ilerleme kaydettiğini doğruluyoruz. Ayrıca, seronegatifliği uzatan viral ve konakçı faktörleri araştırırız. Son olarak, ART'a rağmen persistan HIV vireminin birlikte görülmesi üzerine rapor veriyoruz ve humoral bağışıklık cevabının yokluğu ile olan ilişkisi üzerine spekülasyon yapıyoruz. Git: YÖNTEMLER Hastanın öyküsü, fizik muayene bulguları, HIV antikor taraması, viral RNA direnci profillemesi ve rutin kan takibi dahil olmak üzere klinik tanı ve değerlendirme yoluyla elde edilen sonuçları sunuyoruz. Aksi belirtilmedikçe tüm durumlarda standart ticari kitler kullanılmıştır. Hasta, klinik verilerin gizli tutulması için bilgilendirilmiş onam verdi. İnsan İmmün Yetmezlik Virüs Testi Enfeksiyon sonrası 48 ay kadar HIV testi için bir IgM / IgG ELISA testi (AxSYM HIV-1 / HIV-2 gO 3. nesil immünoassay) kullandık, 4. kuşak ELISA testi bölgemizde standart olarak sunuldu (4. -jenerasyon deneyleri, IgM / IgG'ye ek olarak p24 antijenini içerir). Deney hatasını seronegatiflik nedeni olarak hariç tutmak için, sonuçlar ikinci bir deneyle (Bio-Rad üçüncü kuşak immünoassay; Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) ve Western leke ile teyit edildi. Enfeksiyonun ortaya çıkışı üzerine yeni olduğunu teyit etmek için HIV için nükleik asit amplifikasyon testi, hastanın son negatif rutin tarama testi anında (başlangıç ​​semptomlarından 1 ay önce) -70 ° C'de saklanan 0.7 mL plazma örneği üzerinde gerçekleştirildi. ). Viral Test Hastanın virüsünü antijenite açısından test ettik. Periferal kan tek-çekirdekli hücreleri ([PBMC'ler] 5 x 10 6 ), Ficoll gradyan santrifüj ile izole edilmiş ve% 10 cenin sığır serumu ile Roswell Park Memorial Institute ortamı 1640 daha sonra kültüre edildi. Kültürler daha önce tarif edildiği gibi rekombinant interlökin-2 ve fitohemaglutinin ile uyarıldı [ 10 ]. Hastanın virüsünü içeren ortam 3, 5, 7 ve 10. günlerde hasat edildi. Virüs gece boyunca PEG8000 ile çöktürüldü ve bir mikro santrifüjde 13 000 rpm'de santrifüjle konsantre edildi. Virüs pelletleri Laemmli örnek tamponu [ 11 ] içinde yeniden süspanse edildi ve% 10 sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi ile ayrıldı. Hastanın virüsü ile bir Western blot uygulandı: Filtreler, yüksek nötralize edici antikor titreleri olan farklı bir HIV bulaşmış kişiden alınan serum ile kuluçkaya yatırıldı [ 12 ]. Bulaşıcı virüs parçacıkları (1 x 10 5 ), her bir şeride yüklendi ve lekelenir sera 1: seronegatif hasta için 100 ve 1: 500 seropozitif kontrolü için. Biz ve klon amplifiye etmek için PCR kullanılır , nef , önceki protokolleri [kullanılarak, gen 13 konsensüs ile karşılaştırıldığında değiştirilmiş bir hastalık ilerlemesi ile ilişkili herhangi bir bilinen değişiklikleri belirlemek için,] nef , HIV-1 NL4-3 [suşları prototip dizileri 14 ] ve yu-2 [ 15 ]. Ana Faktörler İnfluenza A (H1N1) pdm09, tetanoz antitoksin ve polisakkarit pnömokok antijenleri dahil olmak üzere doğal antijen eksikliklerini (iltifat ve niceliksel Igs) test ederek ve humoral yanıtın miktarını belirleyerek humoral yanıtın eksikliğini açıklayabilecek potansiyel konak etken faktörleri inceledik. Sürekli Viremia ART'dan önemli seçim basıncına uzun süre maruz kalınmasına rağmen ART direncinin olmamasını inceledik: 0 ve 3'te serum numunelerinden elde edilen PBMC'lerden cDNA ve proviral DNA'dan elde edilen dizilerle ters transkriptaz (RT) ve nef genlerinde genetik evrim analizi yaptık Enfeksiyondan yıllar sonra. Yöntem herhangi bir yerde rapor edilmiştir [ 13 , 16 ]. Ayrıca, hücresel bağışıklık tepkisini de değerlendirdik: persistan viremi için bir açıklama olarak sitotoksik T-lenfosit (CTL) kaçış mutasyonlarının ortaya çıkışını ekarte etmek için, ART başlangıcından 4, 10 ve 18 ay sonra siliko analizlerde uyguladık. Hastanın pol ve nef amino asit sekanslarını, Sitotoksik T-Lenfosit T-Hücresi Epitop Varyantı ve Kaçış Mutasyon Veritabanı ile çapraz referansladık ve ayrıca Los Alamos HIV moleküler immünoloji veritabanı tarafından sağlanan İmmün Epitop Veri Tabanındaki epitop bağlama tahmini aracıydı ( Şu adresten temin edilebilir: http://www.hiv.lanl.gov/ ). Bağırsak ile ilişkili lenfoid doku, HIV replikasyonu ve ilaç direnci [için önemli bir rezervuarı 16 - 18 ]. Düzenli kolon kanseri taramasının bir parçası olarak hastaya rutin gastrointestinal biyopsiler yapıldı. Non-nukleosid RT inhibitörleri (NNRTIs) ve nükleosid RT inhibitörleri (NRTI) ilaç direnç profilleri, daha önce tarif edilen yöntemlerle bu gastrointestinal biyopsilerden iç içe geçmiş PCR ürünleriyle klonal sekanslama ile doğrulanmıştır [ 13 , 16 ]. Vireminin bozulma hızı, yeni enfekte olmuş hücrelerin ömrünün bir fonksiyonu olduğu düşünülmektedir; bu nedenle, kalıcı vireminin yarı ömrünü değerlendirdik [ 19 ]. Hastanın yapışık olmadığı veya viral yük önceki ölçümden arttığı zaman ölçümleri hariç tuttuk. Git: SONUÇLAR Seropozitif kontrolümüzden alınan serum, NL4-3 [ 14 ] ve YU2 prototip suşlarına olduğu gibi, olgu hastasının virüsünden gp120'ye karşı benzer immünreaktiviteye sahipti [ 15 ]. Bununla birlikte, durum, hastanın serum bir konakçı yerine viral faktör humoral immün tepkisi, (Şekil eksikliği sorumlu olduğunu göstermektedir prototip HIV suşlarının veya durum, hastanın virüse karşı gp120 için immünoreaktivite yoktu (Şekil 2 2 ). Uzamış Seronegatiflik Çoklu ELISA (AxSYM, HIV-1 / HIV-2 GO 3. nesil immüno deneyi) ve Western Blot analizleri negatif (Tablo idi (Tablo 1). 1 ). İlk sunumdan 3 yıl sonra on HIV-1/2 ELISA testi negatifti (sinyalden kesilme oranı aralığı, 0.32-0.43 [> 1.0 pozitif test için kesildi]). Tüm ELISA sonuçları, ikinci bir deneyle (Bio-Rad 3. jenerasyon immüno-tahlil) teyit edildi. 45 aylık enfeksiyondan sonra hasta, 4. nesil ELISA (sinyalden kesilme oranı, 2.3) ve Western Blot ile belirsiz (zayıf bant, p24'de antikor tespit edilmedi) ile zayıf pozitif test edildi. İlk antikorlar ilk sunumdan 49 ay sonra (ELISA sinyal / kesme oranı, 9.1) tespit edildi, gp41 ve gp120 / 160'da çok zayıf bantlar tespit edildi. Sonraki testler 4. nesil immünoassay ile (4. nesil MİMARLIK HIV Ag / Ab Combo; Abbott, Chicago, IL) pozitif kaldı. Ana Faktörler Hastanın, uzun süren serokonversiyon süresini açıklayacak hiçbir bağışıklık yetersizliği bulgusu yoktu. Sunum sırasında kantitatif Ig (IgA, IgM ve IgG) ve komplement testi (C4, C4 ve CH50) bağışıklık yetersizliği bulgusu göstermedi. İnsan lökosit antijeni yazımı HLA-A * 11, * 24; B * 08, * 35; C * 07, * 04; DRB1 * 03, * 07; DRB3 * 01; DRB4'e * Şimdiki; Ve DQB1 * 02: 01, 02. Hasta aynı zamanda influenza A (H1N1) pdm09 (prevaccine titeri, 1:10, postvaccine titeri> 1: 1280) ve tetanoz antitoksin (postvaccine titeri, 0.26 IU / mL, referans> 0.1 IU / mL), hastanın HIV'e karşı seronegatif kalmasına rağmen. Hasta, HIV'e karşı hala seronegatif iken, HIV tanısından 5 ay sonra uygulanan T hücresine bağımlı ve bağımsız antijenler de dahil olmak üzere, 23 valanlı pnömokok polisakkarid aşısının tüm serotiplerine yeterli serolojik yanıt verdi (Ek Tablo 1). Viral Faktörler Virüs, RT geninin sekans analizi ile HIV tip 1, grup M, alt tip B idi. 3, 10, 18, 44 ve 61 aylarda plazma RNA'sının (Vircotype HIV-1; Janssen Diagnostics, Beerse, Belçika) genotipik direnç testi, virüsün NNRTI'lere, NRTI'lere ve proteaz inhibitörlerine (PI'lar) panele duyarlı olduğunu gösterdi. Virüs, sanal fenotiplendirme (Trofile Co-reseptör Tropizm Testi, Monogram Biosciences, San Francisco, CA) tarafından tropik CCR5 idi. Prototip soylarından gelen konsensüs nef dizileri ile karşılaştırıldığında ekleme, silme veya amino asit mutasyonları yoktu. Yukarıda belirtildiği gibi, PBMC kültürlemesi ile hastadan elde edilen virüs, Western blot analizi diğer hastalar (Şekil pozitif gp 120 alınan serum ile reaksiyona sokulur Şekil 2) 2 ) prototip virüslere benzer viral zarfının bir tek antijenlik göstermektedir. Sürekli Viremia Uygun ART'ye ve HIV yaşam döngüsünün çeşitli aşamalarında aktif olan farklı antiretroviral ajanların kullanılmasına rağmen, düşük seviyeli HIV viremi, 5 yıl devam etti. Üretilen PCR ürünlerinin klonal dizilemesi ile hiçbir NNRTI veya NRTI direnci tespit edilmedi. RT'nin ilk genetik değerlendirmesi bazı nükleotid değişikliklerini gösterdiğinden 3 yıllık örnekler için klon miktarını genişletmeye karar verdik. Bir klonun, NNRTI'ye düşük seviyedeki dirençle ilişkili olan bir E138G mutasyonu vardı. Bu, 12 klondan saptanan NRTI veya NNRTI direnci ile ilişkili tek mutasyondu. 3 yıllık materyalden türetilen diğer klonlardan bazıları, HXB2 ile karşılaştırıldığında 1 veya 2 amino asit değişikliği göstermesine karşın, hiçbiri NRTI veya NNRTI'ye (S163G, K43R, K46R, L34F, F130S, K104E'ye karşı direnç gelişiminin göstergesi değildi) , Ve E204G). Seriler arasındaki ortalama mesafe 3 yılda 0.0057 ± 0.0028 idi. Genel olarak, 3 yıllık sürekli ART ve persistan viremiye rağmen gastrointestinal örneklerin herhangi birinde bulunan herhangi bir zaman noktasında belirgin bir ilaç direnci mutasyonu saptanmadı. Ayrıca, tipik olarak korunmuş nef genini 3 yılda değerlendirdik ve prototip HXB2 ve NL4-3 suşlarına kıyasla bir ekleme (nükleik asit pozisyon 8880: GCCAGCAGCAGT) gösterdik. HXB2 için bu sonuçta ortaya çıkan amino asit değişiklikleri AEPAADRVGAA'dan AEPAAEPAAVGVGAA'ya kadar olup, bunlar prototip HIV-1 YU-2'de bulunan eklemelere benzer ve diğer izolatlarda da bulunur [ 13 , 20 ]. Bildiğimiz kadarıyla, bu bulguların değişen patogenezi ile bağlantılı olduğu görülmemektedir. ART başladıktan sonra herhangi bir CTL kaçış mutasyonu tespit etmedik. HXB2 pol (273-282) 'de, VPLDEDFRKY'nin VPLDkDFRKY'ye amino asit değişikliği ile sonuçlanan bir CTL epitop varyantı, beklenen progresyondan daha hızlı olan iki hastanın HLA B * 35-Px'li daha önceki bir raporda tanımlandı [ 21 ]. Hiçbir nef hümoral bir cevabın oluşturulması için yetersizlik açıklıyor epitop mutasyonları veya varyantı tespit edilmiştir. Viral çürümenin 2 farklı evresi tespit ettik: ilk 20 haftanın ortalama yarılanma ömrü 14 gündü. Önümüzdeki 5 yıl için, hesaplanan ortalama yarılanma ömrü 270 gün (39 hafta) idi. Ana Faktörler Persistan viremiyi açıklayan anlamlı ilaç direnci mutasyonları ya da tanımlanabilir diğer viral faktörlerin hiçbir kanıtı olmamasından dolayı, kalıcı vireminin bir açıklaması olarak subterapötik ART düzeylerini ekarte etmeye karar verdik. Lopinavir ve ritonavir için kantitatif serum serum testi, hasta önceden bildirimde bulunmadan geriye dönük olarak yapıldı. Lopinavir yalak% 95 etkili konsantrasyonun (EC95) oldukça üstündeydi: minimum lopinavir düzeyi = 3640 ng / mL, trough EC95 = 926 ng / mL [ 22 ]. Diğer iki numune, yem seviyeleriyle tutarlıydı: sindirimden 2 saat sonra ve bir rasgele seviyede sırasıyla (lopinavir = 9970 ng / mL ve 12 400 ng / mL; ritonavir = 1270 ng / mL ve 1210 ng / mL). Dahası, hasta, eczane dolum verileri tarafından doğrulanan>% 95 ART uyumu bildirdi. (Birden fazla farklı sınıflar da dahil olmak üzere), ART geçiş zamanda hasta (Şekil seronegatif kalmıştır viral bastırılmasının elde edilmesi için başarısız (Şekil 1). 1 ). Ayrıca, uygunluğun ikincil kanıtı, zidovüdin öngörülürken (genelde yaklaşık 90 fL / hücre zidovudin öngörülmedikçe> 100 fL / hücre, zidovüdin öngörülürken normal aralığa geri döndüğü zaman) ortalama vücut hacminde beklenen bir artışı içermektedir. Hasta ayrıca, lopinavir öngörülmemiş iken çözünen reçete edilen ritonavir ile güçlendirilmiş lopinavir olduğunda, devamlı sulu dışkı tarif etti. Git: TARTIŞMA Bildiğimiz kadarıyla, bu çalışmadaki hasta seronegatif HIV enfeksiyonunun en uzun rapor süresine sahiptir ve enfeksiyon ile serokonversiyon arasında 49 ay gecikmiştir [ 23 ]. Hastamızda görülen akut HIV enfeksiyonunun şiddetli sunumu, diğer seronegatif HIV hastalarında bildirilen sunumlara benzer şekilde, akut HIV'e yanıt olarak hümoral bağışıklık sisteminin AIDS'e ilerlemenin ertelenmesinde hayati olacağını düşündürmektedir. Akut HIV enfeksiyonuyla en uyumlu semptomları olan sunumundan sadece bir ay önce depolanan bir numunenin nükleik asit amplifikasyon testi ile hastanın HIV negatif olduğu doğrulanmıştır. Hasta, akut HIV hastalığından sadece 4 ay sonra AIDS'i tanımlayan hastalıklarla son derece hızlı bir ilerleme kaydetti. "Hızlı ilerleme" terimi enfeksiyonun 5 yıl içinde AIDS'e ilerleyen bir grup hastayı tanımlamak için kullanılır [ 24 , 25 ]. Bildiğimiz kadarıyla bu hasta AIDS'e belgelenmiş herhangi bir vakadan daha hızlı ilerlemiştir. "Elit denetleyiciler" alt grubuna benzer şekilde, enfeksiyonun altı ay içinde AIDS geliştiren hızlı ilerleyicilerin bir alt grubu "son derece hızlı ilerleyiciler" olabilir. Olumuz, yetersiz bir hümoral bağışıklık tepkisinin hızlı HIV ilerlemesine katkıda bulunma ihtimalini kuvvetlendirmektedir. Uygun ART'ye ve yeterli CD4 geri kazanımına rağmen, hasta plazma viral yükünde HIV'e özgü antikorlar geliştirmedi veya viral supresyona 4 yıldır ulaşamadı. Seronegatif HIV hastalarının diğer raporlarına benzer şekilde, görünüşte başka şekilde normal bir bağışıklık fonksiyonu belgelemektedir [ 1 ]. Bakımının ilgi çekici bir yönü, enfeksiyondan hemen sonra prednison için yüksek doz (günlük dozlar ve kümülatif doz) aldığıdır. Kortikosteroidler çoğunlukla ortak enfeksiyonlar bağlamında [ 26 ] immünosüpresif etkileri için yaygın olarak kullanıl- malarına rağmen [ 27 ], antikor üretimini baskıladığı bilinmemektedir [ 28 ]. Tedavinin kesilmesinden sonra bir kortikosteroid etkisinin o kadar uzun sürmesi imkansız gibi görünüyor. Hasta' (HXB2 E277K) ve HLA allelleri (B * 08 ve B * 35), suboptimal hücresel immün yanıtlardan hızlı HIV ilerlemesiyle ilişkili olabilir [ 21 , 29 , 30 ]. HLA allelleri, CTL-epitop varyantı ve kortikosteroidlerin etkileşiminin sinerjik etkileri olduğunu ve bu da yüksek spekülatif olmasına rağmen hümoral immün tepkinin hızla ilerlemesine ve yetersiz olmasına neden olabilir. Bu vakanın ilginç bir özelliği kalıcı viremidir. Yüksek viral yükler birkaç bildirilmiş seronegatif HIV olgusunun tutarlı bir özelliği gibi gözükmesine rağmen [ 1 ], bildirilen hayatta kalan vakaların bir kısmı, ART ile immün rekonstrüksiyon sonrasında hızla seroconverted. Bu durumda, viral direnç serum viral yükünü baskılamanın başarısızlığını açıklamıyor; Dahası, kendi kendine bildirilen mükemmel uyum plazma ART seviyeleri terapötik konsantrasyonların çok üstünde ve zidovudin ile artan kırmızı kan hücresi ortalama hücre hacmi gibi uyumun ikincil belirteçleri tarafından desteklendi. Serum ve bağırsak mukozasından elde edilen viral dizilerin dizilimi de dahil olmak üzere çoklu viral direnç testleri, virüsün ART'ye duyarlı kaldığını kanıtladı. Buna rağmen, Viral replikasyonun bastırılması, PI'ler, NRTI'ler, NNRTI'ler ve integraz inhibitörleri de dahil olmak üzere çok sayıda farklı antiretroviral sınıfla ortaya çıkmadı. Geçici düşük seviye viremi zaman zaman ART sırasında ortaya çıkmasına rağmen, persistan vireminin viral direnç olmadığı sürece oluştuğu bilinmemektedir [ 31 ]. Bu dava, hümoral bağışıklık sisteminin HIV viral baskılanmasında yaşamsal rolü için sağlam delillere katkıda bulunmaktadır. Mevcut ART tedavisi, viral girişten çoklu basamakları inhibe edebilmesine rağmen, entegrasyon için virüs üretimini azaltmakta ya da viral klirensi artıraamaması nedeniyle sınırlıdır [ 32 ]. Bu dava, tek başına antikorlarla geçici viral kontrol elde edilebilen monoklonal antikor tedavisinin son zamanlarda başarısına kanıt ekledi [ 7 , 8 ]. Hastamızın persistan viremisinin kaynağı, halihazırda enfekte CD4 hücrelerinden ve sürekli HIV rezervuar aktivasyonundan kaynaklanmış olabilir. Viremia çürümesi muhtemelen enfekte olmuş hücrelerin ömrünün bir fonksiyonudur. YÜT'in ilk 20 haftası için yarılanma ömrü yaklaşık 2 hafta, Çürüme fazı II ile tutarlı (enfekte makrofajlardan olduğu düşünülmektedir) [ 19 ]. Daha sonra, yarılanma ömrü faz III bozunumla tutarlı olarak yaklaşık 39 hafta daha uzun sürdü [ 19 ]. Dolayısıyla, virüsü üreten hücreler nispeten daha uzun süre yaşar -HV rezervuarını temsil etme olasılığı daha yüksektir. Antiretroviral tedavinin kendisi HIV replikasyonunu kontrol etmek için yetersiz olabilir: hümoral bağışıklık yanıtı, HIV replikasyonunun kontrolünde ve ART ile veya ART olmadan temizlenmesinde hayati bir rol oynayabilir. Virüsü üreten hücreler nispeten daha uzun süre yaşıyor - HIV rezervuarını temsil etme olasılığı daha yüksek. Antiretroviral tedavinin kendisi HIV replikasyonunu kontrol etmek için yetersiz olabilir: hümoral bağışıklık yanıtı, HIV replikasyonunun kontrolünde ve ART ile veya ART olmadan temizlenmesinde hayati bir rol oynayabilir. Virüsü üreten hücreler nispeten daha uzun süre yaşıyor - HIV rezervuarını temsil etme olasılığı daha yüksek. Antiretroviral tedavinin kendisi HIV replikasyonunu kontrol etmek için yetersiz olabilir: hümoral bağışıklık yanıtı, HIV replikasyonunun kontrolünde ve ART ile veya ART olmadan temizlenmesinde hayati bir rol oynayabilir. Git: SONUÇLAR AIDS'e aşırı derecede hızla ilerleyen ve 49 ay sonra serokonversiyona kadar viral baskılanma sağlamayan bir hastada seronegatif HIV enfeksiyonu olgusunu sunuyoruz. Bu gibi vakalar, bağış yapan kişinin kan tedarikini korumak için hâlâ HIV antikorunun saptanması (3. nesil ELISA) kullanan programlar için nadir ama önemli bir zorluk oluşturmaktadır. Bu dava, viral antijen saptamayı içeren 4. nesil testlerin hızla ve yaygın bir şekilde benimsenmesi ihtiyacını göstermektedir. Bu davadan çıkarılabilecek klinisyenler için bazı pratik öneriler var. Seronegatif HIV enfeksiyonu olan hastalar, AIDS'e hızlı ilerleme için yakından izlenmelidir. Yeterli ART'ye rağmen viral replikasyonu baskılamayan ve mükemmel yapışma rapor eden herhangi bir hastada, serum ART seviyeleri bir emilim sorununu ekarte edebilir. Oldukça ender görülen bu ender viremi vakalarında ve ART direncinin yokluğunda hastanın hastalığı hızla ilerleme riski yüksek olduğu için ART uygulanmaya devam edilmelidir. Sekans verileri ve bir serolojik yanıt yokluğu, antijenik olmayan bir viral varyanttan kaynaklanmıyordu. Antikor üretme başarısızlığının altında yatan mekanizma, diğer bulgulanabilir bağışıklık yetersizliklerinin bulunmadığı durumlarda konakla ilişkili ve HIV'e özgü olduğu görülmüştür; Bununla birlikte, sebep belirsizdi. HIV'e karşı eksik bir humoral yanıt, hastamızda 2 merak bulgusu açıklayabilir: (1) AIDS'e son derece hızlı ilerleme ve (2) uygun ART'ye rağmen HIV viremisini baskılamamadaki yetersizliği. Yeterli ART ve CD4 hücre iyileşmesine rağmen sınırlı devam eden viremiler, vireminin temizlenmesinde immün yanıtın önemine dair bir ipucu sunmaktadır. Bu dava, özellikle fonksiyonel bir HIV tedavisi ararken, antikor bazlı aşı ve terapi gelişimine destek sağlamaktadır. Bu patofizyolojik bilgiler, kronik HIV enfeksiyonunu kontrol etmek için antikora dayalı tedavinin gerekli olabileceğini önermektedir. Git: Teşekkür Ayrıntılı insan bağışıklık eksikliği virüsü test sonuçlarını bildirdikleri için Dr. Kevin Fonseca'ya teşekkür ediyoruz. Yazar katkıları. MJG, çalışma fikrini tasarladı. RACS el yazmasını taslak hazırladı. F. vd M. ve G. v. M. kritik deneyler yaptı. Tüm yazarlar el yazması üzerinde kritik düzeltmeler yapmışlardır. Finansal destek.  Calgary Üniversitesi'ndeki Tom Norquay Vakfı çalışmamıza bazı fon sağladı. Potansiyel çıkar çatışmaları. Tüm yazarlar: Bildirilen çatışma yok. Tüm yazarlar, Potansiyel Çıkar Çatışmalarının Açıklanması için ICMJE Formunu gönderdiler. Uzamış Seronegatiflik Çoklu ELISA (AxSYM, HIV-1 / HIV-2 GO 3. nesil immüno deneyi) ve Western Blot analizleri negatif (Tablo idi (Tablo 1). 1 ). İlk sunumdan 3 yıl sonra on HIV-1/2 ELISA testi negatifti (sinyalden kesilme oranı aralığı, 0.32-0.43 [> 1.0 pozitif test için kesildi]). Tüm ELISA sonuçları, ikinci bir deneyle (Bio-Rad 3. jenerasyon immüno-tahlil) teyit edildi. 45 aylık enfeksiyondan sonra hasta, 4. nesil ELISA (sinyalden kesilme oranı, 2.3) ve Western Blot ile belirsiz (zayıf bant, p24'de antikor tespit edilmedi) ile zayıf pozitif test edildi. İlk antikorlar ilk sunumdan 49 ay sonra (ELISA sinyal / kesme oranı, 9.1) tespit edildi, gp41 ve gp120 / 160'da çok zayıf bantlar tespit edildi. Sonraki testler 4. nesil immünoassay ile (4. nesil MİMARLIK HIV Ag / Ab Combo; Abbott, Chicago, IL) pozitif kaldı. Ana Faktörler Hastanın, uzun süren serokonversiyon süresini açıklayacak hiçbir bağışıklık yetersizliği bulgusu yoktu. Sunum sırasında kantitatif Ig (IgA, IgM ve IgG) ve komplement testi (C4, C4 ve CH50) bağışıklık yetersizliği bulgusu göstermedi. İnsan lökosit antijeni yazımı HLA-A * 11, * 24; B * 08, * 35; C * 07, * 04; DRB1 * 03, * 07; DRB3 * 01; DRB4'e * Şimdiki; Ve DQB1 * 02: 01, 02. Hasta aynı zamanda influenza A (H1N1) pdm09 (prevaccine titeri, 1:10, postvaccine titeri> 1: 1280) ve tetanoz antitoksin (postvaccine titeri, 0.26 IU / mL, referans> 0.1 IU / mL), hastanın HIV'e karşı seronegatif kalmasına rağmen. Hasta, HIV'e karşı hala seronegatif iken, HIV tanısından 5 ay sonra uygulanan T hücresine bağımlı ve bağımsız antijenler de dahil olmak üzere, 23 valanlı pnömokok polisakkarid aşısının tüm serotiplerine yeterli serolojik yanıt verdi (Ek Tablo 1). Viral Faktörler Virüs, RT geninin sekans analizi ile HIV tip 1, grup M, alt tip B idi. 3, 10, 18, 44 ve 61 aylarda plazma RNA'sının (Vircotype HIV-1; Janssen Diagnostics, Beerse, Belçika) genotipik direnç testi, virüsün NNRTI'lere, NRTI'lere ve proteaz inhibitörlerine (PI'lar) panele duyarlı olduğunu gösterdi. Virüs, sanal fenotiplendirme (Trofile Co-reseptör Tropizm Testi, Monogram Biosciences, San Francisco, CA) tarafından tropik CCR5 idi. Prototip soylarından gelen konsensüs nef dizileri ile karşılaştırıldığında ekleme, silme veya amino asit mutasyonları yoktu. Yukarıda belirtildiği gibi, PBMC kültürlemesi ile hastadan elde edilen virüs, Western blot analizi diğer hastalar (Şekil pozitif gp 120 alınan serum ile reaksiyona sokulur Şekil 2) 2 ) prototip virüslere benzer viral zarfının bir tek antijenlik göstermektedir. Sürekli Viremia Uygun ART'ye ve HIV yaşam döngüsünün çeşitli aşamalarında aktif olan farklı antiretroviral ajanların kullanılmasına rağmen, düşük seviyeli HIV viremi, 5 yıl devam etti. Üretilen PCR ürünlerinin klonal dizilemesi ile hiçbir NNRTI veya NRTI direnci tespit edilmedi. RT'nin ilk genetik değerlendirmesi bazı nükleotid değişikliklerini gösterdiğinden 3 yıllık örnekler için klon miktarını genişletmeye karar verdik. Bir klonun, NNRTI'ye düşük seviyedeki dirençle ilişkili olan bir E138G mutasyonu vardı. Bu, 12 klondan saptanan NRTI veya NNRTI direnci ile ilişkili tek mutasyondu. 3 yıllık materyalden türetilen diğer klonlardan bazıları, HXB2 ile karşılaştırıldığında 1 veya 2 amino asit değişikliği göstermesine karşın, hiçbiri NRTI veya NNRTI'ye (S163G, K43R, K46R, L34F, F130S, K104E'ye karşı direnç gelişiminin göstergesi değildi) , Ve E204G). Seriler arasındaki ortalama mesafe 3 yılda 0.0057 ± 0.0028 idi. Genel olarak, 3 yıllık sürekli ART ve persistan viremiye rağmen gastrointestinal örneklerin herhangi birinde bulunan herhangi bir zaman noktasında belirgin bir ilaç direnci mutasyonu saptanmadı. Ayrıca, tipik olarak korunmuş nef genini 3 yılda değerlendirdik ve prototip HXB2 ve NL4-3 suşlarına kıyasla bir ekleme (nükleik asit pozisyon 8880: GCCAGCAGCAGT) gösterdik. HXB2 için bu sonuçta ortaya çıkan amino asit değişiklikleri AEPAADRVGAA'dan AEPAAEPAAVGVGAA'ya kadar olup, bunlar prototip HIV-1 YU-2'de bulunan eklemelere benzer ve diğer izolatlarda da bulunur [ 13 , 20 ]. Bildiğimiz kadarıyla, bu bulguların değişen patogenezi ile bağlantılı olduğu görülmemektedir. ART başladıktan sonra herhangi bir CTL kaçış mutasyonu tespit etmedik. HXB2 pol (273-282) 'de, VPLDEDFRKY'nin VPLDkDFRKY'ye amino asit değişikliği ile sonuçlanan bir CTL epitop varyantı, beklenen progresyondan daha hızlı olan iki hastanın HLA B * 35-Px'li daha önceki bir raporda tanımlandı [ 21 ]. Hiçbir nef hümoral bir cevabın oluşturulması için yetersizlik açıklıyor epitop mutasyonları veya varyantı tespit edilmiştir. Viral çürümenin 2 farklı evresi tespit ettik: ilk 20 haftanın ortalama yarılanma ömrü 14 gündü. Önümüzdeki 5 yıl için, hesaplanan ortalama yarılanma ömrü 270 gün (39 hafta) idi. Ana Faktörler Persistan viremiyi açıklayan anlamlı ilaç direnci mutasyonları ya da tanımlanabilir diğer viral faktörlerin hiçbir kanıtı olmamasından dolayı, kalıcı vireminin bir açıklaması olarak subterapötik ART düzeylerini ekarte etmeye karar verdik. Lopinavir ve ritonavir için kantitatif serum serum testi, hasta önceden bildirimde bulunmadan geriye dönük olarak yapıldı. Lopinavir yalak% 95 etkili konsantrasyonun (EC95) oldukça üstündeydi: minimum lopinavir düzeyi = 3640 ng / mL, trough EC95 = 926 ng / mL [ 22 ]. Diğer iki numune, yem seviyeleriyle tutarlıydı: sindirimden 2 saat sonra ve bir rasgele seviyede sırasıyla (lopinavir = 9970 ng / mL ve 12 400 ng / mL; ritonavir = 1270 ng / mL ve 1210 ng / mL). Dahası, hasta, eczane dolum verileri tarafından doğrulanan>% 95 ART uyumu bildirdi. (Birden fazla farklı sınıflar da dahil olmak üzere), ART geçiş zamanda hasta (Şekil seronegatif kalmıştır viral bastırılmasının elde edilmesi için başarısız (Şekil 1). 1 ). Ayrıca, uygunluğun ikincil kanıtı, zidovüdin öngörülürken (genelde yaklaşık 90 fL / hücre zidovudin öngörülmedikçe> 100 fL / hücre, zidovüdin öngörülürken normal aralığa geri döndüğü zaman) ortalama vücut hacminde beklenen bir artışı içermektedir. Hasta ayrıca, lopinavir öngörülmemiş iken çözünen reçete edilen ritonavir ile güçlendirilmiş lopinavir olduğunda, devamlı sulu dışkı tarif etti. Git: TARTIŞMA Bildiğimiz kadarıyla, bu çalışmadaki hasta seronegatif HIV enfeksiyonunun en uzun rapor süresine sahiptir ve enfeksiyon ile serokonversiyon arasında 49 ay gecikmiştir [ 23 ]. Hastamızda görülen akut HIV enfeksiyonunun şiddetli sunumu, diğer seronegatif HIV hastalarında bildirilen sunumlara benzer şekilde, akut HIV'e yanıt olarak hümoral bağışıklık sisteminin AIDS'e ilerlemenin ertelenmesinde hayati olacağını düşündürmektedir. Akut HIV enfeksiyonuyla en uyumlu semptomları olan sunumundan sadece bir ay önce depolanan bir numunenin nükleik asit amplifikasyon testi ile hastanın HIV negatif olduğu doğrulanmıştır. Hasta, akut HIV hastalığından sadece 4 ay sonra AIDS'i tanımlayan hastalıklarla son derece hızlı bir ilerleme kaydetti. "Hızlı ilerleme" terimi enfeksiyonun 5 yıl içinde AIDS'e ilerleyen bir grup hastayı tanımlamak için kullanılır [ 24 , 25 ]. Bildiğimiz kadarıyla bu hasta AIDS'e belgelenmiş herhangi bir vakadan daha hızlı ilerlemiştir. "Elit denetleyiciler" alt grubuna benzer şekilde, enfeksiyonun altı ay içinde AIDS geliştiren hızlı ilerleyicilerin bir alt grubu "son derece hızlı ilerleyiciler" olabilir. Olumuz, yetersiz bir hümoral bağışıklık tepkisinin hızlı HIV ilerlemesine katkıda bulunma ihtimalini kuvvetlendirmektedir. Uygun ART'ye ve yeterli CD4 geri kazanımına rağmen, hasta plazma viral yükünde HIV'e özgü antikorlar geliştirmedi veya viral supresyona 4 yıldır ulaşamadı. Seronegatif HIV hastalarının diğer raporlarına benzer şekilde, görünüşte başka şekilde normal bir bağışıklık fonksiyonu belgelemektedir [ 1 ]. Bakımının ilgi çekici bir yönü, enfeksiyondan hemen sonra prednison için yüksek doz (günlük dozlar ve kümülatif doz) aldığıdır. Kortikosteroidler çoğunlukla ortak enfeksiyonlar bağlamında [ 26 ] immünosüpresif etkileri için yaygın olarak kullanıl- malarına rağmen [ 27 ], antikor üretimini baskıladığı bilinmemektedir [ 28 ]. Tedavinin kesilmesinden sonra bir kortikosteroid etkisinin o kadar uzun sürmesi imkansız gibi görünüyor. Hasta' (HXB2 E277K) ve HLA allelleri (B * 08 ve B * 35), suboptimal hücresel immün yanıtlardan hızlı HIV ilerlemesiyle ilişkili olabilir [ 21 , 29 , 30 ]. HLA allelleri, CTL-epitop varyantı ve kortikosteroidlerin etkileşiminin sinerjik etkileri olduğunu ve bu da yüksek spekülatif olmasına rağmen hümoral immün tepkinin hızla ilerlemesine ve yetersiz olmasına neden olabilir. Bu vakanın ilginç bir özelliği kalıcı viremidir. Yüksek viral yükler birkaç bildirilmiş seronegatif HIV olgusunun tutarlı bir özelliği gibi gözükmesine rağmen [ 1 ], bildirilen hayatta kalan vakaların bir kısmı, ART ile immün rekonstrüksiyon sonrasında hızla seroconverted. Bu durumda, viral direnç serum viral yükünü baskılamanın başarısızlığını açıklamıyor; Dahası, kendi kendine bildirilen mükemmel uyum plazma ART seviyeleri terapötik konsantrasyonların çok üstünde ve zidovudin ile artan kırmızı kan hücresi ortalama hücre hacmi gibi uyumun ikincil belirteçleri tarafından desteklendi. Serum ve bağırsak mukozasından elde edilen viral dizilerin dizilimi de dahil olmak üzere çoklu viral direnç testleri, virüsün ART'ye duyarlı kaldığını kanıtladı. Buna rağmen, Viral replikasyonun bastırılması, PI'ler, NRTI'ler, NNRTI'ler ve integraz inhibitörleri de dahil olmak üzere çok sayıda farklı antiretroviral sınıfla ortaya çıkmadı. Geçici düşük seviye viremi zaman zaman ART sırasında ortaya çıkmasına rağmen, persistan vireminin viral direnç olmadığı sürece oluştuğu bilinmemektedir [ 31 ]. Bu dava, hümoral bağışıklık sisteminin HIV viral baskılanmasında yaşamsal rolü için sağlam delillere katkıda bulunmaktadır. Mevcut ART tedavisi, viral girişten çoklu basamakları inhibe edebilmesine rağmen, entegrasyon için virüs üretimini azaltmakta ya da viral klirensi artıraamaması nedeniyle sınırlıdır [ 32 ]. Bu dava, tek başına antikorlarla geçici viral kontrol elde edilebilen monoklonal antikor tedavisinin son zamanlarda başarısına kanıt ekledi [ 7 , 8 ]. Hastamızın persistan viremisinin kaynağı, halihazırda enfekte CD4 hücrelerinden ve sürekli HIV rezervuar aktivasyonundan kaynaklanmış olabilir. Viremia çürümesi muhtemelen enfekte olmuş hücrelerin ömrünün bir fonksiyonudur. YÜT'in ilk 20 haftası için yarılanma ömrü yaklaşık 2 hafta, Çürüme fazı II ile tutarlı (enfekte makrofajlardan olduğu düşünülmektedir) [ 19 ]. Daha sonra, yarılanma ömrü faz III bozunumla tutarlı olarak yaklaşık 39 hafta daha uzun sürdü [ 19 ]. Dolayısıyla, virüsü üreten hücreler nispeten daha uzun süre yaşar -HV rezervuarını temsil etme olasılığı daha yüksektir. Antiretroviral tedavinin kendisi HIV replikasyonunu kontrol etmek için yetersiz olabilir: hümoral bağışıklık yanıtı, HIV replikasyonunun kontrolünde ve ART ile veya ART olmadan temizlenmesinde hayati bir rol oynayabilir. Virüsü üreten hücreler nispeten daha uzun süre yaşıyor - HIV rezervuarını temsil etme olasılığı daha yüksek. Antiretroviral tedavinin kendisi HIV replikasyonunu kontrol etmek için yetersiz olabilir: hümoral bağışıklık yanıtı, HIV replikasyonunun kontrolünde ve ART ile veya ART olmadan temizlenmesinde hayati bir rol oynayabilir. Virüsü üreten hücreler nispeten daha uzun süre yaşıyor - HIV rezervuarını temsil etme olasılığı daha yüksek. Antiretroviral tedavinin kendisi HIV replikasyonunu kontrol etmek için yetersiz olabilir: hümoral bağışıklık yanıtı, HIV replikasyonunun kontrolünde ve ART ile veya ART olmadan temizlenmesinde hayati bir rol oynayabilir. Git: SONUÇLAR AIDS'e aşırı derecede hızla ilerleyen ve 49 ay sonra serokonversiyona kadar viral baskılanma sağlamayan bir hastada seronegatif HIV enfeksiyonu olgusunu sunuyoruz. Bu gibi vakalar, bağış yapan kişinin kan tedarikini korumak için hâlâ HIV antikorunun saptanması (3. nesil ELISA) kullanan programlar için nadir ama önemli bir zorluk oluşturmaktadır. Bu dava, viral antijen saptamayı içeren 4. nesil testlerin hızla ve yaygın bir şekilde benimsenmesi ihtiyacını göstermektedir. Bu davadan çıkarılabilecek klinisyenler için bazı pratik öneriler var. Seronegatif HIV enfeksiyonu olan hastalar, AIDS'e hızlı ilerleme için yakından izlenmelidir. Yeterli ART'ye rağmen viral replikasyonu baskılamayan ve mükemmel yapışma rapor eden herhangi bir hastada, serum ART seviyeleri bir emilim sorununu ekarte edebilir. Oldukça ender görülen bu ender viremi vakalarında ve ART direncinin yokluğunda hastanın hastalığı hızla ilerleme riski yüksek olduğu için ART uygulanmaya devam edilmelidir. Sekans verileri ve bir serolojik yanıt yokluğu, antijenik olmayan bir viral varyanttan kaynaklanmıyordu. Antikor üretme başarısızlığının altında yatan mekanizma, diğer bulgulanabilir bağışıklık yetersizliklerinin bulunmadığı durumlarda konakla ilişkili ve HIV'e özgü olduğu görülmüştür; Bununla birlikte, sebep belirsizdi. HIV'e karşı eksik bir humoral yanıt, hastamızda 2 merak bulgusu açıklayabilir: (1) AIDS'e son derece hızlı ilerleme ve (2) uygun ART'ye rağmen HIV viremisini baskılamamadaki yetersizliği. Yeterli ART ve CD4 hücre iyileşmesine rağmen sınırlı devam eden viremiler, vireminin temizlenmesinde immün yanıtın önemine dair bir ipucu sunmaktadır. Bu dava, özellikle fonksiyonel bir HIV tedavisi ararken, antikor bazlı aşı ve terapi gelişimine destek sağlamaktadır. Bu patofizyolojik bilgiler, kronik HIV enfeksiyonunu kontrol etmek için antikora dayalı tedavinin gerekli olabileceğini önermektedir. Git: Teşekkür Ayrıntılı insan bağışıklık eksikliği virüsü test sonuçlarını bildirdikleri için Dr. Kevin Fonseca'ya teşekkür ediyoruz. Yazar katkıları. MJG, çalışma fikrini tasarladı. RACS el yazmasını taslak hazırladı. F. vd M. ve G. v. M. kritik deneyler yaptı. Tüm yazarlar el yazması üzerinde kritik düzeltmeler yapmışlardır. Finansal destek.  Calgary Üniversitesi'ndeki Tom Norquay Vakfı çalışmamıza bazı fon sağladı. Potansiyel çıkar çatışmaları. Tüm yazarlar: Bildirilen çatışma yok. Tüm yazarlar, Potansiyel Çıkar Çatışmalarının Açıklanması için ICMJE Formunu gönderdiler.